中国罕见病科研及转化医学大会由瑞鸥公益基金会于2022年发起，旨在促进全球罕见病科研与转化的学术交流，并搭建产学研医患多方交流与合作的平台。截至目前，大会已于2022年11月（杭州）和2024年5月（上海）举办两届。
第二届中国罕见病科研及转化医学大会设有20个议题，邀请了来自全球20个国家和地区159余位从事罕见病科研与转化的专家学者进行学术交流。大会共计1680人注册参会，会议期间举办实地走访、线下交流15场，专题研讨会及卫星会10场。
基于DNA视角的Cas9基因编辑疗法
如果我们将研究视角放到DNA中，我们将会知道DNA是被称为组蛋白的蛋白质包裹的，并兼有化学修饰——例如甲基化，这些因素都会影响基因组的解读、折叠方式以及最终的基因表达方式。
如果我们进一步将研究视角放大到组蛋白分子，会发现这些组蛋白尾部的残基被不同的酶大量修饰，这些修饰相当于为基因组加上了书签，细胞通过这些书签来解释如何调控基因组及其内容。
因此，尽管几乎所有细胞都有相同的基因组，但由于表观遗传的调控机制，不同组织或细胞中会有不同的基因表达，以实现特定组织所需的功能。而且在某些疾病中，正如姜永辉教授之前提到的，有时是因为某些基因没有表达，才出现了这些疾病。
因此，我们希望有不同的治疗方法，而不仅仅是改变基因序列。我们可以使用Cas9实现这一不同的治疗方法，但首先需要进行一些准备。
Cas9具有两个核酸酶结构域，它们可以切割DNA。如果我们对其中一个结构域进行突变，就会得到一种只能切割单链DNA的蛋白质，但如果我们对两个结构域都进行突变，就会得到一种称为dCas9的蛋白质，它能够结合DNA但不切割DNA。
通过这种方式，我们可以使用RNA向导、短RNA将dCas9定位到基因组的任意位置，进而将不同的酶或蛋白质融合在一起。
现在，我们可以通过向导RNA将这些蛋白质或酶带到特定的基因组位点，并在这些特定的基因组位置上进行操作。例如，我们遇到一个基因被沉默的疾病，我们可以将激活因子与dCas9融合，重新激活这个基因；或者，如果某种蛋白质过度表达导致疾病，我们可以将抑制因子与dCas9融合，关闭这个基因的表达。
正如我们之前所说的，组蛋白通过许多不同的修饰来控制基因组的解读方式。因此，我们可以通过不同的酶来扩展这个工具箱，从而更高精度地控制组蛋白修饰在细胞中的表现。
虽然目前已经有许多工具可以实现这一点，但如果我们面对的是涉及多个基因的复杂疾病，该怎么办呢？特别是在基因网络的情况下，如果这些基因以不同的方式被修饰，而我们想要对这些基因进行不同的修饰，我们需要一种更模块化的系统来实现这种多功能操作。
向导RNA与效应蛋白操作系统
我和王皓毅开始思考如何实现这一目标。我们可以通过改造能切割DNA的Cas9使其变成dCas9。现在，我们不是将酶与dCas9融合，而是在向导RNA的自由端插入结合位点，并设计了这些融合了特定RNA结合结构域的有效蛋白质，可以被向导RNA招募。我们选择了一种称为PUF的特定RNA结合蛋白，它可以被重新编程，以结合任何8个碱基的序列。
如果设计了不同的效应蛋白，这些蛋白融合了识别不同RNA序列的不同PUF结构域，那么我们可以通过使用不同的向导RNA、针对不同基因的8个碱基序列，并结合不同的PUF效应蛋白，来有效地生成多功能操作系统。通过这种方式，我们可以在不同的基因组位点上实现多功能操作。
例如，我们可以激活基因1，抑制基因2，甚至可能修改基因3的DNA甲基化。还可以通过控制招募的效应分子的数量，或者形成复合物，来多方面调整表观遗传编辑的效果。因此，在实验室中构建的这个系统实际上是一个综合性的工具箱，可以通过构建这种效应因子库，利用不同的向导RNA，以不同的方式在基因组位点上进行操作，从而编辑任何类型的组蛋白修饰。
这里有两个例子。我们感兴趣的修饰之一是添加H3K27乙酰化。我们使用一种称为CBP的酶，它具有组蛋白乙酰基转移酶结构域，可以证明使用这种方法能激活增强子。我们还研究了DNA去甲基化。我们不是仅仅招募一种酶，而是招募多种参与DNA甲基化多个步骤的酶，并证明可以在基因组位点上形成复合物，增强去甲基化的效率，从而推动甲基化C或更多下游中间体的生成。
我们与香港中文大学合作，对靶向鼻咽癌进行尝试。在NPC细胞中，核内存在EBV episome，而其中有一个特定基因是病毒裂解周期的主要调控因子。所以我们的想法是重新激活裂解周期，从而裂解EBV阳性的癌细胞。为此，我们设计了Casilio向导RNA，它能够结合到EBV基因组上这个主要调控基因的启动子，我们发现可以在mRNA和蛋白质水平上有效激活这个主要基因的表达。
向导RNA与效应蛋白操作系统的递送
为了真正解决靶向鼻咽癌的治疗问题，我们需要递送该操作系统。于是我们使用了一种较小的激活系统——TALE。利用程序化的TALE结构域，可以结合到EBV基因组上的相同结合位点，并与激活因子连接，通过这种方式，也可以激活EBV的裂解周期。
接下来，我们想看看是否能递送这一系统。因此，我们研究了非常流行的系统，或者说更出名的——mRNA脂质纳米颗粒（LNP）递送系统。我们尝试使用与辉瑞疫苗中非常相似的配方，然后将我们的TALE激活因子编码到mRNA中，经过修饰的mRNA，并生产这些纳米颗粒分子。
如幻灯片所示，我们可以将LNP递送到细胞中，并可以激活这个主要调控因子，启动裂解周期。我们研究了EBV阴性细胞的特异性，在我们的预期中不会有任何表达变化，结果也确实如此。我们没有看到太多的表达变化，说明这个系统相对较为特异。
而当我们研究EBV阳性细胞，引入这种激活因子LNP时，我们可以看到大多数被激活的基因来自EBV基因组，这也与我们激活EBV裂解周期的想法是一致的。
现在治疗的想法是，我们有了这种由mRNA编码的激活分子，将其封装在mRNA脂质纳米颗粒中，通过静脉注射，进入肿瘤细胞或正常细胞。对于正常细胞，因为靶点只存在于EBV基因组中，所以不会有任何影响。但是当它进入EBV阳性细胞时，它可以结合到那个主要调控基因上，启动EBV裂解周期，并裂解这些细胞。有趣的是，其中一个下游效应基因是胸苷激酶。使用这种药物，它可以将这种GCV药物转化为一种细胞毒性药物，能够扩散并杀死周围的细胞。
因此，利用这一优势，我们不需要在所有100%的细胞中递送激活因子。如果我们能将激活因子递送到肿瘤组织中约5%或10%的细胞中，就能有效消除整个肿瘤。正如幻灯片现在显示的就是肿瘤细胞的死亡情况。
我们所做的正是使用这种纳米颗粒注射、植入，造一个模型，在不同的时间点注射纳米颗粒和药物。幻灯片这里展示的是肿瘤体积随时间变化的图表。我们可以看到，使用这种激活因子纳米颗粒，与对照组相比，我们能够抑制肿瘤的生长。这就像激活因子的方法一样，但在某些情况下，我们只需要激活癌细胞，启动一次裂解周期并杀死癌细胞。但在许多表观遗传编辑的情况下，我们可能需要长期激活或抑制某个基因。
另一个研究组进行了一项研究，他们找到了通过表观遗传瞬时递送的方法来长期沉默某个基因，使用DNA甲基转移酶并结合抑制因子，构建这种靶向PCSK9基因的合成转移因子。只需要一次剂量，他们就能看到该基因的持续抑制，以及胆固醇水平的下降。这令人非常兴奋，不过在我们可以将其应用于其他场景之前，我们仍然需要找到一种长期激活表观遗传编辑的方法。
靶向内含子的向导RNA操作系统
我们前面只谈到了DNA，实际上转录成RNA之后还会发生很多事情。包括剪接、翻译、定位，这些过程中的任何错误都可能导致疾病。因此，我们也希望能够开发更多工具来编辑这些过程以用于治疗。
关于RNA我们的研究想法与前面研究DNA的想法非常相似。几年前，首次发现了RNA靶向CRISPR，我们的想法是为这种RNA靶向CRISPR制造RNA核缺陷版本。随后你可以引导它到RNA靶点，并将dCas与参与这些不同步骤的不同RNA酶融合，以期能够诱导不同的效果。我们尝试了将其应用于剪接，使用dCas13蛋白并将其与剪接因子融合。我们设计了靶向内含子的向导RNA。我们现在可以激活外显子的包含形式。
通过转换，我们可以有效地将主要的外显子排除形式表达转换为包含形式表达，如幻灯片这里通过靶向目标外显子下游的内含子区域所示。我们尝试了这种方法，看看它是否能用于某种疾病。
为证明原理，我们以脊髓性肌萎缩症（SMA）为例，取患者的成纤维细胞，使用这种人工剪接因子，我们可以看到，通过靶向需要被包含以达到治疗效果的外显子7下游的内含子，我们可以增加SMA患者成纤维细胞中包含外显子7的全长转录本的表达。
我们还对系统进行了改进。在某些疾病中，可能在RNA过程中存在多个干扰，因此，我们发明了这个系统，可以多重操作不同的功能，类似于Casilio在DNA上的例子，我们可以将不同的效应蛋白固定在不同的RNA靶点上，以诱导不同的RNA操作。
接下来，我将简单介绍我们在传感器方面的工作，这些传感器可以识别RNA或DNA序列，这样我们就可以做出反应，即可能将来有一天基因疗法能够对它所在的细胞做出响应。我的梦想是建立一个系统，我们可以通过检测到序列或细胞表达状态，然后使用一些逻辑将其与这些表观遗传编辑器连接起来，从而引导实现相对应的治疗效果。
在幻灯片的最后，我向实际参与这些研究的人们以及为项目研究提供资金支持的组织致谢。
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