摘 要：建立了液相色谱-串联三重四极杆质谱（LC-MS/MS）同位素内标法同时检测海参中的甲氰菊酯和扑草净。样品经乙腈提取，浓缩后LC-MS/MS分析，同位素内标法标准曲线定量。结果表明，甲氰菊酯在0～100 ng/mL、扑草净在0～50 ng/mL范围内线性良好，相关系数均在0.999以上。方法定量限：甲氰菊酯5.0 μg/kg，扑草净1.0 μg/kg。在5.0～50 μg/kg添加水平下，甲氰菊酯平均回收率在82.4%～102%之间，RSD小于6%;在1.0～50 μg/kg添加水平下，扑草净平均回收率在104%～115%之间，RSD小于3%。其中甲氰菊酯的回收率明显优于外标法，甲氰菊酯和扑草净的精密度均优于外标法。
关键词：同位素内标法;液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）;海参;甲氰菊酯;扑草净
内标法是在分析测定样品中某组分含量时，将一个已知质量且样品中不含有的纯物质加入至待测样品中，以此纯物质的量为标准，对比测定待测组分的含量。加入的纯物质称为内标物。内标物的种类较多，其中的同位素内标物因与待测组分具有相似的结构和化学性质，可以降低质谱检测的基质效应，校正待测组分在样品前处理中的损失，因而成为液相色谱-串联质谱分析中内标物的首选。本文建立了液相色谱-串联质谱同位素内标法检测海参中的甲氰菊酯和扑草净。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
LC-20AD液相色谱仪（日本岛津）、QTRAP 4500 三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX）、百分之一电子天平（赛多利斯）、平行蒸发仪（瑞士BUQI）、TDZ5-WS离心机（湖南湘仪）、MS3涡旋混合器（IKA）、JYS-A8000绞肉机（九阳）。
甲氰菊酯1 000 μg/mL（丙酮）、扑草净1 000 μg/mL（丙酮）、甲氰菊酯-D5：均为FirstStandard;扑草净-D6 100 μg/mL（丙酮）：DR。
标准储备液：取适量甲氰菊酯和扑草净的标准溶液，氮气吹干溶剂后，用乙腈定容成100 μg/mL的储备溶液。
混合标准溶液：取适量标准储备液，用乙腈稀释成1 000 ng/mL的混合标准溶液。
甲氰菊酯-D5储备液：用乙腈配制成100 μg/mL的储备液。
扑草净-D6储备液：取适量扑草净-D6标准溶液，氮气吹干溶剂后，用乙腈定容成100 μg/mL的储备液。
混合内标标准溶液：取适量甲氰菊酯-D5储备液和扑草净-D6储备液，用乙腈稀释成1 000 ng/mL的混合内标标准溶液。
乙腈和甲醇（HPLC Grade，Merck）、甲酸（HPLC Grade，DIKMA）、0.2 μm滤膜（PALL），实验所用水为超纯水。
定容溶液：乙腈和水体积比1∶1混合。
1.2 试样制备
海参去内脏后切成小块后混匀，绞肉机绞碎，装入洁净容器中，密封，-20 ℃保存。
1.3 样品前处理
称取5.00 g样品（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入混合内标标准溶液100 μL，涡旋混匀1 min，室温静置不少于30 min。加入10 mL乙腈，3 000 r/min涡旋混匀2 min，4 000 r/min离心5 min，上清液移入25 mL比色管中;残渣中再加入10 mL乙腈，3 000 r/min涡旋混匀2 min，超声5 min，4 000 r/min离心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，乙腈定容至25.0 mL，混匀备用。
准确移取5.00 mL提取液45 ℃ 蒸发至干。准确加入2.00 mL定容溶液溶解残渣，溶液经0.2 μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱分析。
1.4 液相色谱-串联质谱条件
液相色谱条件：色谱柱 AccucoreTM aQ（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱温40 ℃，流速0.5 mL/min，进样量5 μL，流动相A为 0.005 mol/L 乙酸铵溶液（含0.3% 甲酸），B为甲醇;梯度洗脱程序：0～1 min，10%B;1～3 min，10%B～90%B;3～5 min，90%B;5～5.1 min，90%B～10%B;5.1～7 min，10%B。
質谱条件：电喷雾离子源（ESI），多反应扫描（MRM）正离子模式，喷雾电压5 500 V，气帘气30 PSi， 碰撞气Medium;温度550 ℃;雾化气：55 PSi;辅助加热气：55 PSi。质谱条件及参数见表1。
1.5 标准系列配制
取混合标准溶液和混合内标标准溶液用定容溶液稀释成0.5、1.0、2.0、5.0、10、25、50、100 ng/mL的标准系列，其中内标含量为10.0 ng/mL。
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的确定
分别取1 μg/mL的标准溶液通过蠕动泵注入质谱中，寻找母离子、子离子和碰撞能，并优化去簇电压和碰撞池出口电压。甲氰菊酯和甲氰菊酯-D5的母离子选择加NH+4离子m/z 367.1和m/z 372.2，因为加NH+4母离子产生的子离子m/z 125.1产生的信号强且干扰少。
2.2 前处理条件的确定
实验发现中性氧化铝柱对甲氰菊酯和扑草净的净化作用不明显，故省去中性氧化铝柱的净化步骤[1]。
2.3 线性范围
以浓度为横坐标，定量离子与内标物子离子的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线。甲氰菊酯在0～100 ng/mL、扑草净在0～50 ng/mL范围内均呈现良好线性关系，线性系数r>0.999，见表2。四种物质的多反应扫描质量色谱图见图2。
2.4 回收率和精密度
通过空白样品添加标准物质的方式进行回收率和精密度测试，添加梯度为1.0、5.0、10、50 μg·kg-1，回收率和精密度见表3和表4。由表中数据可知，在5.0～50 μg·kg-1添加范围内，甲氰菊酯平均回收率在82.4%～102%之间，RSD在1.89%～5.26%之间;在1.0～50 μg·kg-1添加范围内，扑草净平均回收率在104%～115%之间，RSD在1.28%～2.71%之间。
2.5 定量限
通过分析表3和表4中的回收率和RSD值，甲氰菊酯的定量限可定为5.0 μg·kg-1，扑草净的定量限可定为1.0 μg·kg-1。
2.6 实际样品检测
检测实际样品38份，检测结果与外标法[1]和气-质联用法[2-3]一致。
3 结论
本方法建立了液相色谱-串联质谱同位素内标法同时检测海参中的甲氰菊酯和扑草净。前处理操作更加简单[2-3]，甲氰菊酯的回收率优于外标法[1]，甲氰菊酯和扑草净的精密度均优于外标法[1]。
参考文献：
[1] 马瑞欣，周凡，李雪萍，等.液相色谱-串联质谱法测定海参中的甲氰菊酯和扑草净含量[J].河北渔业，2021（7）：22-24.
[2] 中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员.动物性食品中有机氯农药和拟除虫菊酯农药多组分残留量的测定：GB/T 5009.162-2008[S].北京：中国标准出版社，2009：1-16.
[3] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.进出口食品中扑草净残留量检测方法 气相色谱-质谱法： SN/T 1968-2007[S].北京：中国标准出版社，2008：1-6.
